Introduction
Materials and Methods
시약 준비
네슬러 시약 제작
미세유체칩 몰드 제작
검출 플랫폼 제작
암모니아 측정 플랫폼
암모니아 측정
암모니아 측정 플랫폼 검증
데이터 통계
결과 및 토론
미세유체칩 평가
암모니아 감지 센서의 특성
Conclusion
Introduction
암모니아는 비료 공장, 냉동 시스템, 화학 공장 등 다양한 산업 분야에서 활용되는 화학물질이다(Mishra et al., 2014). 일반적으로 암모니아는 하천이나 지하수에서 0.2 ppm 이하로 극미량 존재한다(Edition, 2011; Ritter, 2002). 그러나 생활과 농업 폐수 등에 다량 함유된 암모니아가 별도의 정화 처리를 거치지 않고 유출되었을 때, 암모니아의 강력한 독성으로 인해(Yan et al., 2020) 수질 오염을 초래할 수 있다(Muniraj et al., 2012; Senra-Ferreiro et al., 2011). 또한 암모니아 생산 시설에서 유출될 경우 생태계 오염 원인이 되며(Zhang et al., 2020a), 공기나 물을 통해 인체로 흡수 시 장기 및 점막에 손상을 줄 수 있다(Gan et al., 2022). 이러한 이유로 미국(Regulations and Standards, 1985), 영국(UKTAG, 2008), 호주(Batley and Simpson, 2009) 등 일부 국가에서는 식수뿐만 아니라 해양과 담수에서 암모니아 허용 기준치를 설정하고 있다(Galvão et al., 2013; Li et al., 2020). 따라서 환경오염 예방 및 식수원 보존을 위해 수중 암모니아를 모니터링하는 것은 중요하다(Abd Rashid et al., 2024; Bavili Tabrizi and Sepehr, 2015).
기존의 수중 암모니아 측정 센서는 비싼 가격과 복잡한 계측 장비 등으로 인해 현장 모니터링에는 적합하지 않다(Thakur and Devi, 2024). 따라서 가격이 저렴하고 계측이 간단한 암모니아 센서에 관한 연구가 필요하며, 이에 대한 관련 연구가 다수 진행되고 있다(Ke et al., 2018; Li et al., 2020). 수중 암모니아를 측정하는 방식에는 여러 방식이 있지만, 대표적인 측정 방법으로는 전기화학, 전기전도도, 광학 측정 방식이 있다(Alwael et al., 2024; Duong and Rhee, 2014; Li et al., 2020). 전기화학 측정 방식은 높은 감도, 저렴한 측정 비용이라는 특징이 있다(Zhang et al., 2020b). 전기전도도 측정 방식은 우수한 환경 안정성을 가지고 있지만, 시간과 비용이 많이 필요하고 복잡한 계측 장비가 요구된다. 사용이 용이하고 가격이 저렴하며 판독이 편리한 광학 측정 방식이 주목받고 있다(Cheng et al., 2012). 광학 측정 방법 중 하나인 비색 측정에 관한 다양한 연구가 보고되었으며(Alwael et al., 2024; Batley and Simpson, 2009), 비색 측정을 위해 인도페놀 블루(Ivančič and Degobbis, 1984), 브로모틸몰 블루(Clinch et al., 1988) 등 다양한 시약이 개발되어 사용되고 있다. 하지만 암모니아 비색 측정을 위해 사용되는 시약들은 페놀(Quint et al., 1998), 수은(Gassim, 2023) 등 동식물에게 해로운 물질이 포함되어 있다(Waich et al., 2008). 해로운 물질을 최소화하기 위해, 소량의 시약과 시료를 사용하여 대상 물질을 정밀하게 측정하는 방법으로 현장진단검사(Luppa et al., 2011), 신속 검사 스트립(Ngom et al., 2010), 미세유체칩(Gallardo- Gonzalez et al., 2019; Pol et al., 2017) 등이 있다. 그중에서도 미세유체칩은 소량의 시약으로 높은 민감도와 빠른 반응 시간을 제공하는 여러 장점이 있어 연구가 활발히 이루어지고 있다(Gallardo-Gonzalez et al., 2019; Jang et al., 2011; Molins-Legua et al., 2006; Nxumalo et al., 2020; Pol et al., 2017; Tan et al., 2022; Timmer et al., 2006).
미세유체칩은 미세관에 유체를 흘려보내 층류를 형성하는 원리를 활용하여, 다양한 재료와 설계를 바탕으로 소량의 시약을 사용해 물질을 측정하거나 혼합하는 장치이다(Fujii, 2002; Lim et al., 2010; Tan et al., 2012). 이러한 미세유체칩은 정확한 제어가 가능하며, 높은 재현성과 민감도를 제공하고 소형화가 용이하여 휴대성이 뛰어나다(Mark et al., 2010). 또한, 미세유체칩은 비용 효율이 높고 반응 시간을 단축시킬 수 있으며(Dkhar et al., 2023; Luka et al., 2015), 필요한 시약과 샘플의 양이 적어 비용 절감이 가능하다(Sharma and Sharma, 2022). 기존의 대량 샘플 처리 시스템과 비교하여 신속하고 효율적인 데이터 수집이 가능하며(Dkhar et al., 2023), 다양한 조건에서 실험을 반복 수행할 수 있다(Haeberle and Zengerle, 2007). 이러한 미세유체칩은 주로 현장 진단 검사와 관련된 연구에 사용되며(He et al., 2016; Ho et al., 2015; Zhang et al., 2016), 이외에도 화학 분석(Mark et al., 2010), 의료 분야(Arshavsky-Graham and Segal, 2020) 등 여러 분야에서 활용된다(Sin et al., 2011). 그러나 미세유체칩의 복잡한 제조 공정으로 인해 다양한 분야에 적용되기 어렵다(Chan et al., 2015). 이러한 복잡한 공정을 개선하기 위해, 3D 프린팅 기술을 사용하여 미세 유체 시스템을 제작하는 시도가 다수 보고되고 있다(Chan et al., 2015; Comina et al., 2014; Yazdi et al., 2016). 3D 프린팅 기술을 이용하여 미세유체칩을 제작하면 기존 제작 방법인 실리콘 웨이퍼 방법과 비교하여 저렴하고 간단하게 제작할 수 있다(Gross et al., 2017). 특히, 3D 프린팅을 이용한 미세유체칩 제작 시 LED 센서 삽입과 다양한 높이차를 가지는 3차원적 기하학적 구조 설계를 용이하게 하며(Waheed et al., 2016), 3차원적 기하학적 구조를 가진 미세유체칩의 제조 공정을 단축하는 데 매우 유용하다(Kojic et al., 2019). 이를 통해 미세유체칩의 제작 시간과 비용을 크게 절감할 수 있으며, 맞춤형 설계가 가능하여 다양한 연구 요구에 부응할 수 있다(Ha et al., 2018).
본 연구에서는 미세유체칩 기반 비색 측정 시스템을 개발하여 암모니아를 검출하는 방법을 제시하였다. 산업 폐수와 광산에서 수중으로 배출되는 암모니아 농도를 측정하기 위해, 센서의 검출 범위를 0-100 ppm으로 설정하였다. 이 범위는 산업 폐수와 광산 배출물에서 흔히 나타나는 20-110 ppm의 농도뿐만 아니라, 자연수에서 발견될 수 있는 최대 12 ppm의 암모니아 농도, 그리고 미국 환경보호청(EPA)이 규정한 0.25-32.5 ppm의 농도를 모두 포함하도록 설정되었다. 또한, 개발된 미세유체칩은 광 투과성이 높은 소재인 PDSM(Chen et al., 2016)을 기반으로 제작하여 칩 내부에서 발생하는 비색 변화를 효과적으로 관측할 수 있었다(Pinto et al., 2019). 암모니아 측정 가능 범위 및 검출 한계에 대한 실험을 통해 이 시스템이 자연수에서의 암모니아 농도를 측정하는 데 적합함을 확인하였다. 또한, 미세유체칩의 수명에 관한 실험을 통해 칩이 몇 번 재사용 가능한지도 검증하였다. 본 연구를 통해 미세유체칩의 제작 비용이 저렴하고, 복잡한 측정 장비 없이 수중 암모니아를 측정할 수 있어 수중 암모니아 측정에 용이한 것으로 판단된다.
Materials and Methods
시약 준비
암모니아 측정을 위해 제작된 플랫폼과 미세유체칩의 성능을 확인하기 위하여 마젠타 잉크(HP GT/samsung DYE(GT52/M610), Photomax, 대한민국)를 사용하였다. 암모니아 농도 측정을 위한 시약은 Lab Grade의 네슬러 시약(Nessler’s reagent solution, K2HgI4, 덕산 종합 과학, 대한민국)이 사용되었다. 암모니아 32% 용액(ammonia solution 32%, Merck Group, 독일)과 순수(D. I Water, DAEJUNG, 대한민국)는 CP 등급이 사용되었다. 농도별 암모니아 용액은 암모니아 32% 용액과 순수를 사용하여 0-100 ppm 범위로 제작되었다. 미세유체칩을 제작하기 위해 PDMS(SYLGARD™ 184 Silicone Elastomer Kit, DOW, 미국)와 슬라이드 글라스(slide glass, Microscope Slide Glass, Marienfeld, 독일)가 사용되었다.
네슬러 시약 제작
시중에서 판매되는 네슬러 시약은 암모니아에 대한 민감도가 높아 검출 한계가 0.2 ppm으로 알려져 있다(McLean et al., 1978). 그러나 시중에서 판매되는 네슬러시약은 본 연구의 검출 목표인 0-100 ppm 농도의 암모니아를 측정하는 데는 적합하지 않다. 이를 해결하기 위해 네슬러 시약을 순수와 희석하여 사용하였다(Nxumalo et al., 2020). 수중 암모니아를 측정하기 위한 최적의 네슬러 시약 농도를 결정하기 위해, 5% v/v씩 차이를 두고 네슬러 시약을 순수와 희석하여 시약을 제작하였다. 이렇게 희석된 네슬러 시약을 0-100 ppm 농도의 암모니아 용액과 반응시킨 후, 마이크로 플레이트 리더기(1681130, Bio-Rad, 미국)를 사용하여 흡광도 차이를 확인하였다. 실험 결과, 15% v/v이하의 농도에서는 10-30 ppm의 암모니아를 정확하게 측정하기 어려웠으며, 30% v/v이상의 농도에서는 60-100 ppm의 암모니아에서 농도별 흡광도가 차이가 나타나지 않아 농도별 측정이 불가능하였다. 따라서 20% v/v농도의 네슬러 시약이 0-100 ppm 범위의 암모니아 농도를 측정하는 데 적합함을 확인하였고, 본 연구에서는 20% v/v로 희석한 네슬러 시약을 사용하였다.
네슬러 시약은 수은을 포함하고 있어 위험성이 존재하지만, 본 연구에서는 시중에 판매되는 네슬러 시약을 순수와 희석하여 사용함으로써 기존보다 위험성을 낮추었다. 또한, 사용된 샘플 및 세척액은 폐액 통에 수집되어 폐기된다.
미세유체칩 몰드 제작
미세유체칩의 형상을 제작하기 위해 3차원 설계 프로그램인(3D Computer-Aided Design, 3D CAD) 인벤터(Inventer, Autodesk, USA)가 사용되었다. 3D CAD를 사용하여 모델링된 파일은 슬라이싱 소프트웨어에서 사용하기 위해 STL(stereo lithography) 형식으로 저장되었다. STL파일로 저장된 파일은 슬라이싱 소프트웨어인 PreForm(Formlabs, USA)와 Cura (UltiMaker, 네덜란드)를 통해 3D 프린터용 G-code로 변환되었다. 광경화수지 조형방식(Stereo Lithography Apparatus, SLA)의 3D 프린터(Form 3+, Formlabs, 미국)로 출력된 미세유체칩 몰드의 잔여 레진은 Form Wash(Formlabs, USA)와 Isopropyl Alcohol 99%(이소프로필알콜 99%, IPA, 에코켐, 대한민국)를 사용하여 제거되었다. 이후 Form 3+로 프린팅 된 몰드를 경화시키기 위해 UV 경화기(Formlabs, 미국)가 사용되었다.
검출 플랫폼 제작
플랫폼 출력을 위해 PLA(Polylactic Acid) 필라멘트(DYAIR, 중국)를 사용할 수 있는 용융 적층 모델링 방식(Fused Deposition Modeling, FDM)의 3D 프린터(Ender-3 Pro, Creality, 중국)를 사용하여 암모니아 농도를 측정하기 위한 센싱 플랫폼을 제작하였다. 제작된 플랫폼에는 암모니아 비색 검출을 위한 AS 7262 스펙트럼 센서(SEN-14347(1568-1741-ND), sparkfun, 미국)가 사용되었으며, 센서 구동 및 데이터 송수신을 위해 아두이노 우노(Arduino UNO R3, Arduino, 이탈리아)가 사용되었다. 미세유체칩에 시약 및 시료는 실린지 펌프(ISOLab01, SHENCHEN, 대한민국)와 10 mL 주사기(Kovax-syringe, 한국백신, 대한민국)를 이용하여 미세유체칩으로 공급하였다. 미세유체칩 내 시약 및 시료의 통로는 1.5mm biopsy punch(BP-15F, Kai medical, 일본)로 제작된 구멍을 통해 이동하며, 실린지 펌프와 미세유체칩 모듈의 통로는 내경 0.4 mm, 외경 1.6 mm인 실리콘 튜브(HSW silicone hose, 대한민국)와 22 Gauge를 이용하여 연결되었다.
암모니아 측정 플랫폼
암모니아 측정을 위한 플랫폼을 개발하기 위해 시약들을 효과적으로 혼합하고 반응 및 검출할 수 있도록 혼합부, 반응부, 검출부로 구성된 3D 모델을 설계하였다. 설계된 몰드는 슬라이싱 소프트웨어 PreForm을 사용하여 G-code로 변환되었으며, Form 3+ 3D 프린터로 Standard resin V4 clear(FLGPCL04, Formlabs, 미국)를 이용해 출력되었다. 출력된 몰드는 IPA가 들어있는 Form Wash에서 20분간 세척하고, 이후 UV 경화기에서 55℃에서 40분 동안 경화시켜 미세유체칩 몰드를 제작하였다.
제작된 몰드에 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합한 PDMS를 부어 진공 오븐(sh-vdo-08ng, 삼흥과학, 대한민국)에서 진공을 만들어 몰드 안의 PDMS에 존재하는 기포를 제거하였다. 제거된 기포 후 70℃에서 2시간 동안 열을 가하여 PDMS를 경화시켰다. 경화된 PDMS를 몰드에서 제거한 후 슬라이드 글라스에 부착하여 미세유체칩을 완성하였다. 각 모듈은 3 cm 길이의 실리콘 튜브로 연결되었다(Fig. 1).
미세유체칩에 LED와 AS 7262 스펙트럼 센서를 고정하기 위해 인벤터를 사용하여 추가 디자인 작업을 수행하고 STL 파일로 저장하였다. 플랫폼은 미세유체칩을 안정적으로 고정할 수 있도록 설계되었으며, LED와 측정부, AS 7262 스펙트럼 센서가 일직선상에 위치하도록 구성되었다. 이는 측정 시 오차를 최소화하고 센서의 감도를 높이는 데 기여하였다. STL 파일은 Cura 슬라이싱 프로그램을 사용하여 G-code로 변환되었으며, Ender-3 Pro 3D 프린터에서 PLA 필라멘트를 사용하여 출력하였다. 출력 조건은 내부를 입방체 형태로 채우고 스커트를 사용하여 빌드 플레이트에 부착을 돕도록 설정되었으며, 바닥 온도는 60℃, 노즐 온도는 185℃로 설정되었다. 최종 제작된 암모니아 측정 플랫폼은 Fig. 2에서 확인할 수 있다.
본 연구에서는 3D 프린팅 기술을 통해 채널, 주입구, 유출구 등이 포함된 몰드를 제작한 후, 이 몰드를 사용하여 PDMS 블록을 제작하고, 슬라이드 글라스를 부착하는 방법을 사용하였다(Bhattacharjee et al., 2016). 미세유체칩 제작에 사용된 PDMS은 높은 투명도, 저렴한 가격, 우수한 성형성, 가벼운 무게 등의 장점으로 미세유체칩 제작에 널리 사용되고 있다(Zhang et al., 2010). 기존의 실리콘 웨이퍼 기반 제작법에 비해, 3D 프린팅 기술을 사용하면 제작 방법이 간단하고 비용 효율적이다(Brás and de Barros Fernandes, 2024). 또한, 3D 프린팅 기술을 이용하여 미세유체칩을 제작하고, 조립 가능한 모듈형 설계를 도입함으로써 시스템의 유연성과 확장성을 높였다(Bhattacharjee et al., 2016). 이를 위해 미세유체칩을 혼합부, 반응부, 검출부로 구분하고 모듈 형태로 디자인하여 활용성을 높이였다(Lai et al., 2022; Sun et al., 2008).
혼합부는 측정물과 세척액이 미세유체칩으로 유입되는 부분으로, 세 개의 유입구를 설계하여 시약, 시료, 세척액이 각각 관로로 유입될 수 있도록 설계하였다. 이는 시약, 시료 세척액이 각각의 유입구를 통해 미세유체칩으로 유입되어 시료의 오염을 방지하였다. 반응부는 시약과 시료의 반응이 원활하게 이루어지도록 ‘ㄹ’형태로 디자인하였으며(Lee et al., 2005), 이는 반응 시간을 연장시키는 효과를 가지고 있다. 검출부는 비색 측정이 원활하게 이루어지도록 원통 형태로 제작되었다(Pinto et al., 2019). 기포가 발생하여 측정 오차가 생기는 것을 줄이기 위해 원뿔대 형태로 제작하였다(Beilharz et al., 2015). 검출부에서 유입구와 유출구가 동일한 높이에 있을 경우, 시약이 원활하게 모이지 않으므로 유입구와 유출구의 높이를 다르게 제작하였다. 각각의 모듈로 제작된 칩들은 튜브를 사용하여 연결되었다.
암모니아 측정
암모니아 측정을 위해, 실린지 펌프를 사용하여 200 μL의 네슬러 시약과 0-100 ppm 농도의 암모니아 시료를 1분 동안 미세유체칩의 반응부로 주입하였다. 반응 후, AS 7262 스펙트럼 센서를 사용하여 미세유체칩의 검출부에서 반응물의 광도를 1분간 측정하였다. 측정 완료 후, 검출부에 남아 있는 반응액은 400 μL의 순수를 주입하여 완전히 제거하였다.
제작된 시스템의 측정 특성을 확인하기 위하여, 암모니아 측정 플랫폼에서 사용된 동일한 시약과 시료를 이용하여 마이크로 플레이트 리더기를 사용해 0-100 ppm 농도의 암모니아 흡광도를 측정하였다. 이때 사용된 시약과 시료는 암모니아 측정 플랫폼에서 사용된 것과 동일한 시약과 시료가 사용되었다. 네슬러 시약과 암모니아 시료는 1분간 반응시킨 후, 마이크로 플레이트 리더기로 흡광도를 측정하여 암모니아 농도를 정량화하였다.
암모니아 측정 플랫폼 검증
암모니아 측정 플랫폼의 성능을 평가하기 위해, 물과 마젠타 잉크가 1:1비율로 연속 희석법으로 제작된 시료를 각각 400 μL가 미세유체칩에 공급되어 측정부에서 스펙트럼 센서를 이용하여 1분간 광도를 측정하였다. 시료 측정 후 채널 내부에 남아있는 잔여물을 세척하기 위해 400 μL의 순수를 통과시켜 미세유체칩의 관로, 튜브, 검출부를 세척하였다. 이는 센서의 정확성을 확인하기 위해 선정하였다.
데이터 통계
실험 데이터는 암모니아 측정 플랫폼을 이용하여 1분간 측정한 데이터를 사용하였다. 각 측정은 총 세 번 반복 수행되었으며, 이후 평균값과 표준 오차를 계산하였다. 통계를 통해 얻은 평균값과 표준오차를 사용하여 암모니아의 농도를 정량화 하였다.
결과 및 토론
미세유체칩 평가
네슬러 시약과 암모니아의 반응물은 주황색 계열로 나타나며(Nxumalo et al., 2020), 420 nm 영역대에서 흡광도 피크가 나타나는 특성을 가진다(Hao et al., 2019). 제작한 플랫폼의 성능을 확인하기 위해, 네슬러 시약의 반응물과 비슷한 흡광도 피크를 가지는 잉크를 사용하여 제작된 시스템에서 비색 변화를 측정하였다. 이때 사용된 잉크들의 흡광도 피크는 다음과 같다: 마젠타 잉크는 450-580 nm (Szafarska et al., 2011), 마젠타 색과 노란색을 혼합하여 제작한 주황색은 450 nm(Muthamma et al., 2023), 노란색 잉크는 300-500 nm(Szafarska et al., 2011) 영역대의 흡광도 피크를 가진다. 그러나 노란색, 주황색 잉크의 경우, 암모니아 검출 플랫폼과 플레이트 리더기에서 측정값이 정량적이지 않아 잉크의 농도를 구분할 수 없었다(Fig. 3(a)-(f)).
Fig. 3(a), (b)는 주황색 잉크로 제작된 농도별 시약의 흡광도 시험 결과이다. Fig. 3(a)의 결과 750, 655 nm 파장대의 흡광도는 농도에 따른 변화가 없이 0에 가까운 값을 가지는 것으로 나타나며, 농도 변화에 따른 흡광도 차이가 거의 없음을 확인할 수 있다. 595 nm 파장에서는 농도가 12.5%일 때 흡광도가 포화 상태에 도달하는 것으로 나타나, 특히 저농도에서 농도 변화를 감지하는 데 민감하다는 것을 나타낸다. 이외에도 570, 515, 415, 405 nm 파장대에서 농도에 따라 흡광도가 유사하게 나타났으며, 0.78% 이하의 농도에서는 흡광도가 포화되는 경향이 있다. 또 다른 특성을 확인하기 위해 파장대별로 농도별 시료의 흡광도를 조사하였다(Fig. 3(b)). 그 결과 655, 750 nm에서의 시료별 흡광도의 값은 약 0.01로 매우 낮아 농도 차이를 구분하기 어려웠다. 반면, 595 nm에서는 상대적으로 고농도인 0.78% 이하의 농도에서 흡광도는 0.03~0.184까지의 값을 가져 구분이 어려웠으며, 12.5% 이상에서의 농도에서의 흡광도 값은 각각 1.56%에서 0.313, 3.13%에서 0.59, 6.25%에서 0.91, 12.5%에서 1.0의 값을 가져 상대적으로 저농도 시료의 흡광도 값이 잘 구분되는 것을 확인할 수 있었다.
Fig. 3(c), (d)는 노란색 잉크로 제작된 농도별 시약의 흡광도 시험 결과이다. Fig. 3(c)의 결과 750, 655 nm 파장대의 흡광도는 농도에 따른 변화가 없이 0에 가까운 값을 가지는 것으로 나타나며, 농도 변화에 따른 흡광도 차이가 거의 없음을 확인할 수 있다. 595 nm 파장에서는 농도가 25%일 때 흡광도가 포화 상태에 도달하는 것으로 나타나, 특히 저농도에서 농도 변화를 감지하는 데 민감하다는 것을 나타낸다. 이외에도 570, 515, 415, 405 nm 파장대에서 농도에 따라 흡광도가 유사하게 나타났으며, 3.13% 이하의 농도에서는 흡광도가 포화되는 경향이 있다. 또 다른 특성을 확인하기 위해 파장 때 별로 농도별 시료의 흡광도를 조사하였다(Fig. 3(d)). 그 결과 655, 750 nm에서의 시료별 흡광도의 값은 약 0.01로 매우 낮아 농도 차이를 구분하기 어려웠다. 반면, 595 nm에서는 상대적으로 고농도인 0.39% 이상의 농도에서 흡광도는 0.04~0.06까지의 값을 가져 구분이 어려웠으며, 12.5% 이상에서의 농도에서의 흡광도 값은 각각 1.56%에서 0.313, 3.13%에서 0.59, 6.25%에서 0.91, 12.5%에서 1.0의 값을 가져 상대적으로 저농도 시료의 흡광도 값이 잘 구분되는 것을 확인할 수 있었다.
Fig. 3(e), (f)는 마젠타 잉크로 제작된 농도별 시약의 흡광도 시험 결과이다. Fig. 3(e)의 결과 750 nm 파장대의 흡광도는 농도에 따른 변화가 없이 0에 가까운 값을 가지는 것으로 나타나며, 농도 변화에 따른 흡광도 차이가 거의 없음을 확인할 수 있다. 595 nm 파장에서는 농도가 1.56%일 때 흡광도가 포화 상태에 도달하는 것으로 나타나, 특히 저농도에서 농도 변화를 감지하는 데 민감하다는 것을 의미한다. 이외에도 595, 570, 515, 415, 405 nm 파장대에서 농도에 따라 흡광도가 유사하게 나타났으며, 3.13% 이하의 농도에서는 흡광도가 포화되는 경향이 나타났다. 더욱 자세한 특성을 확인하기 위해, 파장대별로 농도별 시료의 흡광도를 확인하였다(Fig. 3(f)). 그 결과 750 nm에서의 시료별 흡광도의 값은 약 0.01로 매우 낮아 농도 차이를 구분하기 어려웠다. 반면, 655 nm에서는 상대적으로 고농도인 0.39% 이상의 농도에서 흡광도는 0.009~0.06까지의 값을 가져 구분이 어려웠으며, 3.13% 이상의 농도에서의 흡광도 값은 각각 0.2%에서 0.29, 0.39%에서 0.16, 0.78%에서 0.12, 1.56%에서 0.059의 값을 가져 상대적으로 저농도 시료의 흡광도 값이 잘 구분되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 네슬러 시약 반응물과 비슷한 흡광도 영역인 노란색, 주황색, 마젠타 잉크 중 모든 농도에서 측정이 가능한 파장이 나타난 마젠타 잉크를 사용하여서 Fig. 2(b)에서와 같이 제작된 미세유체칩에서 성능을 확인하였다. Fig. 3(g)는 마젠타 잉크를 측정한 결과를 나타낸다. 이 그래프에서 570, 600, 650 nm 파장에서 잉크 농도별 값이 명확하게 구분되는 것을 확인할 수 있다. 마젠타 잉크 농도 추정 식의 신뢰도는 각각 0.9882, 0.9291, 0.9181로 나타났다. 이러한 결과는 해당 3가지 파장에서 농도별 잉크 구분이 가능함을 의미한다. 반면, 450, 500, 550 nm 파장에서는 마젠타 잉크의 측정값이 잉크 농도를 측정하기 위한 규칙적인 패턴이 나타나지 않아 농도를 특정하기 어려운 것으로 나타났다. 1:1 비율로 연속 희석법을 사용하여 희석된 잉크를 측정한 결과, 암모니아 측정을 위해 제작된 미세유체칩이 비색 분석을 통해 시료의 농도 구분이 가능하다는 결론을 내릴 수 있다.
Fig. 3.
(a) The microplate reader was used to quantify the concentration of the orange ink, with the resulting data plotted on a graph. (b) The microplate reader was used to quantify the concentration of the orange ink, which was subsequently plotted according to the wavelength. This data is specific to wavelength, not concentration. Inks with low concentration at certain wavelengths cannot be measured, which may result in some values appearing to be absent. (c) The microplate reader was used to quantify the concentration of yellow ink, with the results plotted on a graph. The graph displayed erratic data, indicating that some concentrations exceeded the measuring range of the instrument. (d) The microplate reader was used to quantify the concentration of yellow ink, which was subsequently plotted according to the wavelength. This data is specific to wavelength, not concentration. Inks with low concentration at certain wavelengths cannot be measured, which may result in some values appearing to be absent. (e) The microplate reader was employed to measure the concentration of the yellow ink, with the results plotted on a graph. (f) The microplate reader was used to quantify the concentration of yellow ink, which was subsequently plotted according to the wavelength. This data is specific to wavelength, not concentration. Inks with low concentration at certain wavelengths cannot be measured, which may result in some values appearing to be absent. (g) Measurements were taken with a platform fabricated using magenta ink.
암모니아 감지 센서의 특성
0-100 ppm 농도의 암모니아와 네슬러 시약의 반응물을 마이크로 플레이트 리더기로 측정할 수 있는 파장을 확인하였다. Fig. 4(a)에 나타난 그래프에서 보듯이, 짧은 파장일수록 동일한 시료에 대해 높은 흡광도를 가지는 것으로 관찰되었다. 405, 415, 515 nm 파장에서는 측정하고자 하는 시료에서 암모니아 농도를 정량하기 어려울 정도로 짧은 선형 구간이 나타났다. 405, 415, 515 nm 파장들은 마이크로 플레이트 리더기로 측정할 수 있는 검출 한계를 초과하여, 0-100 ppm 농도의 암모니아 측정이 불가능했다. 반면, 590, 655, 750 nm의 파장에서는 농도별 암모니아의 흡광도가 상대적으로 낮게 측정되었다. 특히, 저농도의 암모니아 시료에서는 비색 변화에 따른 흡광도 변화가 크게 나타나지 않아 암모니아 농도를 특정하기 어려웠다.
따라서, 0-100 ppm 농도의 암모니아를 농도별로 명확하게 수치화가 가능한 570 nm의 파장을 사용하여 암모니아 농도 측정 암모니아 예측 곡선을 제작하였다. 이 암모니아 예측 곡선은 Fig. 4(b)에서 확인할 수 있으며, 암모니아 예측 곡선의 신뢰도는 0.98275로 나타났다. 암모니아 예측 곡선을 사용하여 암모니아 농도 측정 시 대조군으로 사용하기에 적절함을 확인할 수 있었다.
Fig. 4(c)에 나타난 그래프는 본 연구에서 개발한 암모니아 측정 플랫폼을 사용하여 농도별 암모니아 시료를 측정한 결과이다. 이 실험에서 암모니아 시료와 네슬러 시약은 각각 200 μL씩 사용되었다. 검출부에서는 AS 7262 스펙트럼 센서를 사용하여 농도별 암모니아와 네슬러 시약이 혼합된 시료를 1분 동안 측정하였다. 측정 후, 미세유체칩 관로와 측정부를 세척하기 위해 400 μL 순수를 흘려보내 관로를 세척된 후, 제작된 칩을 재사용하였다. 암모니아 농도별로 구분이 가능한 450 nm의 파장을 사용하여 암모니아 농도 예측식을 제작하였다. 제작한 암모니아 농도 예측식은 Fig. 4(d)에서 확인할 수 있으며, 암모니아 농도 예측식의 신뢰도는 0.99905로 나타났다. 이 결과는 본 연구에서 개발한 측정 플랫폼의 높은 정확성과 신뢰성을 보여준다.
Fig. 4.
The variables a and c are indicative of the extent of light absorption, with values increasing in proportion to the darkness of the solution. Conversely, the variables b and d are indicative of light luminosity, which tends to decrease in proportion to the concentration of ammonia. The data represent the mean values, and the error bars indicate the standard deviation, reflecting the variability in the measurements. (a) Measurement of ammonia in water using a microplate reader. (b) Trend line for measuring ammonia concentration in water using microplate reader. (c) The measurement of ammonia in water using the fabricated ammonia measurement platform. (d) The trend line of ammonia concentration measurement in water using the fabricated ammonia measurement platform.
개발한 비색 암모니아 센서와 비교하기 위해 마이크로 플레이트 리더기와 농도 별 암모니아를 비교하였다(Fig. 5(a)). AS 7262 스펙트럼 센서와 마이크로 플레이트 리더기로 측정한 결과, 평균 오차가 3 ppm 이하로 농도별 암모니아 측정이 가능한 것으로 나타났다. 미세유체칩의 재현성을 검증하기 위해 같은 방식으로 제작된 네 개의 미세유체칩을 사용하여 10, 50, 100 ppm 암모니아를 각각 세 번씩 반복 측정하였다. 측정 결과 표준오차는 10 ppm에서는 0.41 ppm, 50 ppm에서는 1.31 ppm, 100ppm에서는 2.7 ppm으로 나타나 재현성이 우수함을 확인하였다(Fig. 5(b)).
암모니아 측정 플랫폼의 수명을 확인하기 위해 동일한 방법으로 제작된 3개의 미세유체칩을 사용하였다. 측정 후 세척된 미세유체칩은 상온에서 보관 후 재사용 하였으며, 첫 사용 후 24시간마다 주기적으로 측정하였다. 이 과정에서 동일하게 제작된 세 개의 칩을 사용하여 수중 암모니아 농도 10, 50, 100 ppm을 측정하였다(Fig. 5(c)). 1~9일까지 매일 한 농도당 3번씩 총 9번 측정한 결과, 평균 표준 편차는 10 ppm에서 1.2 ppm, 50 ppm에서는 1.64ppm, 100 ppm에서 2.7 ppm으로 나타났다. 10일째에는 10 ppm에서는 1.92 ppm(약 19.2%), 50 ppm에서 4.62 ppm(약 9.24%), 100 ppm에서 16.74ppm(약 16.74%) 오차가 나타났다. 10일부터는 측정오차가 약 10% 이상으로, 암모니아 농도의 정확한 측정이 어려운 것으로 나타났다. 따라서, 매일 9회씩 측정할 때 제작된 미세유체칩의 수명은 9일로 판단된다.
Fig. 5.
Ammonia concentration measurement results. The data represent the mean values, and the error bars indicate the standard deviation, reflecting the variability in the measurements. (a) The red line represents the correct value of ammonia concentration, the purple line shows the measurements obtained using the AS7262 spectral sensor in Lab on a chip, and the green line represents the values measured using a plate reader. (b) Reproducibility of the microfluidic chip: Ammonia concentrations at three different concentrations were measured over multiple iterations to assess the reproducibility of the constructed microfluidic chip. (c) Stability of the Lab on a chip over time: Measurements from three identically constructed chips were used to evaluate the lifetime of the Lab on a chip over a 10-day period at three different ammonia concentrations.
Conclusion
본 연구에서는 스펙트럼 센서와 미세유체칩을 활용하여 암모니아 측정 센서를 개발하였다. 이 센서는 10 ppm의 검출 한계를 가지며, 시약과 시료의 반응 시간은 30초 이내로 확인하였으며, 측정까지는 1분이 소요된다. 개발된 센서는 상온에서 안정적인 측정이 가능하며, 동일한 제작 방법으로 만들어진 미세유체칩들을 사용한 재현성 실험을 통해 일관된 측정 결과를 보여주었다. 또한, 모듈 형태로 제작되어 미세유체칩의 활용성이 우수할 뿐만 아니라, 제작된 미세유체칩은 하루 9회 사용 기준으로 총 9일 동안 사용이 가능하다 수명을 다한 미세유체칩 교환으로 제작한 플랫폼에서 수중 암모니아를 다시 측정할 수 있다. 미세유체칩의 제작 비용은 약 3,000원, 암모니아 검출 플랫폼의 총 제작 비용은 50,000원 이하로 측정되어 수중 암모니아 검출 시 저렴한 비용으로, 연속적으로 측정이 가능하다. 그 뿐만 아니라 암모니아 측정을 위해 제작된 플랫폼은 비색으로 측정이 가능한 다른 시약에서도 활용이 가능할 것으로 기대된다.
